Spektralphotometer sind in modernen molekularbiologischen Labors zu Routineinstrumenten geworden. Wird häufig für die Nukleinsäure-, Proteinquantifizierung und Quantifizierung von Bakterienwachstumskonzentrationen verwendet.
Einfaches Prinzip des Spektralphotometers
Das Spektrophotometer verwendet eine Lichtquelle, die mehrere Wellenlängen erzeugen kann, und durchläuft eine Reihe von spektroskopischen Geräten, um eine Lichtquelle einer bestimmten Wellenlänge zu erzeugen. Nachdem die Lichtquelle die zu testende Probe passiert hat, wird ein Teil der Lichtquelle absorbiert und die Absorption der Probe berechnet, wodurch sie in eine Probenkonzentration umgewandelt wird. . Die Extinktion der Probe ist proportional zur Konzentration der Probe.
Quantifizierung von Nukleinsäuren
Die Quantifizierung von Nukleinsäuren ist die am häufigsten verwendete Funktion des Spektrophotometers. Oligonukleotide, einzelsträngige, doppelsträngige DNA und RNA können in einem Puffer quantifiziert werden. Der Absorptionspeak des höchsten Absorptionspeaks der Nukleinsäure beträgt 260 nm. Die molekulare Zusammensetzung jeder Nukleinsäure ist unterschiedlich, daher sind die Umrechnungsfaktoren unterschiedlich. Um verschiedene Arten von Nukleinsäuren zu quantifizieren, wählen Sie die entsprechenden Koeffizienten im Voraus aus. Beispielsweise entspricht die Extinktion von 1 OD 50 & mgr; g / ml dsDNA, 37 & mgr; g / ml ssDNA, 40 & mgr; g / ml RNA und 30 & mgr; g / ml Olig. Die Extinktion nach dem Test wird mit den obigen Koeffizienten umgerechnet, um die entsprechende Probenkonzentration zu erhalten. Wählen Sie vor dem Testen das richtige Verfahren aus, geben Sie das Volumen der Stammlösung und des Verdünnungsmittels ein und testen Sie dann den Blindwert und die Probenlösung. Das Experiment verlief jedoch nicht immer reibungslos. Instabile Messwerte können die größten Kopfschmerzen für den Experimentator sein. Instrumente mit höherer Empfindlichkeit zeigen eine größere Extinktionsabweichung.
Tatsächlich ermöglichen das Konstruktionsprinzip und das Arbeitsprinzip des Spektralphotometers, dass die Extinktion innerhalb eines bestimmten Bereichs variiert, das heißt, das Instrument weist eine bestimmte Genauigkeit und Präzision auf. Beispielsweise beträgt die Genauigkeit des Eppendorf Biophotometers ≤ 1,0% (1A). Die Ergebnisse solcher Mehrfachtests variieren zwischen etwa 1,0% des Mittelwerts und sind normal. Darüber hinaus müssen auch die physikochemischen Eigenschaften der Nukleinsäure selbst und der pH-Wert des Puffers, in dem die Nukleinsäure gelöst ist, die Ionenkonzentration usw. berücksichtigt werden Leseverschiebungen, daher wird empfohlen, einen bestimmten pH-Wert und eine niedrige Ionenkonzentration zu verwenden. Puffer wie TE stabilisieren die Messwerte erheblich. Die Verdünnungskonzentration der Probe ist auch ein Faktor, der nicht ignoriert werden darf: Aufgrund des unvermeidlichen Vorhandenseins einiger feiner Partikel, insbesondere von Nukleinsäureproben, in der Probe. Das Vorhandensein dieser kleinen Partikel stört die Testergebnisse. Um die Wirkung der Partikel auf die Testergebnisse zu minimieren, muss die Extinktion der Nukleinsäure mindestens größer als 0,1 A sein, und die Extinktion liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 1,5 A. Innerhalb dieses Bereichs liegt die Interferenz der Die Partikel sind relativ klein und das Ergebnis ist stabil.
Dies bedeutet, dass die Konzentration der Probe nicht zu niedrig oder zu hoch sein sollte (außerhalb des Testbereichs des Photometers). Schließlich sollten die Betriebsfaktoren, wie Mischen, ausreichend sein, da sonst der Extinktionswert zu niedrig ist, auch negative Werte; die Mischung kann keine Blasen enthalten, die Blindflüssigkeit hat keine Schwebstoffe, sonst driftet der Messwert drastisch; Zum Testen von Blindwert und Probe muss dieselbe Küvette verwendet werden. Andernfalls ist der Konzentrationsunterschied zu groß. der Umrechnungsfaktor und die Probenkonzentrationseinheit werden konsistent ausgewählt; Die Küvette mit Fensterverschleiß kann nicht verwendet werden. Das Volumen der Probe muss das von der Küvette geforderte Mindestvolumen erreichen.
Neben der Nucleinsäurekonzentration zeigt das Spektrophotometer auch einige sehr wichtige Verhältnisse, die die Reinheit der Probe anzeigen, beispielsweise das Verhältnis von A 260 / A 280, das zur Beurteilung der Reinheit der Probe verwendet wird, da der Absorptionspeak des Proteins beträgt 280 nm. Eine reine Probe mit einem Verhältnis von mehr als 1,8 (DNA) oder 2,0 (RNA). Wenn das Verhältnis niedriger als 1,8 oder 2,0 ist, zeigt es das Vorhandensein von Protein oder phenolischen Substanzen an. Ein 230 zeigt an, dass einige Verunreinigungen in der Probe vorhanden sind, wie Kohlenhydrate, Peptide, Phenole usw., und das Verhältnis der reineren Nukleinsäure A 260 / A 230 ist größer als 2,0. Ein 320 erkennt die Trübung der Lösung und andere Störfaktoren. Für reine Proben ist A 320 im Allgemeinen 0.
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