Quantifizierung von Nukleinsäuren in Spektrophotometern
Die Quantifizierung von Nukleinsäuren ist die am häufigsten verwendete Funktion eines Spektrophotometers. Oligonukleotide, einzelsträngige, doppelsträngige DNA und RNA können in Puffern quantifiziert werden. Der Absorptionspeak des höchsten Absorptionspeaks der Nukleinsäure beträgt 260 nm. Jede Nucleinsäure hat eine unterschiedliche molekulare Zusammensetzung und weist daher unterschiedliche Umwandlungsfaktoren auf. Um verschiedene Arten von Nukleinsäuren zu quantifizieren, wählen Sie die entsprechenden Koeffizienten im Voraus aus. Zum Beispiel entspricht die Extinktion von 1OD 50 ug / ml dsDNA, 37 ug / ml ssDNA, 40 ug / ml RNA und 30 ug / ml Olig. Der Extinktionswert nach dem Test wird durch den obigen Koeffizienten umgewandelt, um die entsprechende Probenkonzentration zu erhalten. Wählen Sie vor dem Test das korrekte Verfahren, geben Sie die Volumina der Stammlösung und des Verdünnungsmittels ein und testen Sie die Blind- und Probenlösungen. Das Experiment war jedoch nicht einfach. Instabile Messwerte können für Experimentatoren die größten Kopfschmerzen bereiten. Je höher die Empfindlichkeit des Instruments ist, desto größer ist die gezeigte Extinktionsdrift.
Das Konstruktionsprinzip und das Arbeitsprinzip des Spektralphotometers ermöglichen nämlich, dass sich der Extinktionswert innerhalb eines bestimmten Bereichs ändert, das heißt, das Instrument hat ein gewisses Maß an Genauigkeit und Genauigkeit. Wie Eppendorf Biophotometer Genauigkeit ≤ 1,0% (1A). Die Ergebnisse dieser mehrfachen Tests variieren zwischen dem Mittelwert von 1,0% und sind alle normal. Zusätzlich müssen die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nukleinsäure, der pH-Wert des Puffers zum Auflösen der Nukleinsäure, die Ionenkonzentration usw. berücksichtigt werden: Während des Tests wird eine zu hohe Ionen-Konzentration ebenfalls die Ablesung verursachen Drift als TE, was den Messwert stark stabilisiert. Die verdünnte Konzentration der Probe ist auch ein nicht vernachlässigbarer Faktor: aufgrund der unvermeidlichen Anwesenheit kleiner Teilchen in der Probe, insbesondere Nukleinsäureproben. Das Vorhandensein dieser kleinen Teilchen stört den Test-Effekt. Um den Einfluss der Partikel auf die Testergebnisse zu minimieren, muss die Extinktion der Nukleinsäure mindestens 0,1 A und die Extinktion vorzugsweise 0,1-1,5 A betragen. In diesem Bereich dürfen keine Blasen in der Probe sein Mischung, und es gibt keine Suspendierung im Leerzeichen. Ansonsten driften die Messwerte heftig ab; derselbe kolorimetrische Becher muss verwendet werden, um den Rohling und die Probe zu testen; ansonsten ist der Konzentrationsunterschied zu groß; der Umwandlungskoeffizient und die Probenkonzentrationseinheit sind gleich; Die Küvette am Fenster getragen; das Volumen der Probe muss mehr als das erforderliche Mindestvolumen des Farbbechers usw. erreichen.
Zusätzlich zu der Nukleinsäurekonzentration zeigt das Spektrophotometer mehrere sehr wichtige Verhältnisse gleichzeitig, um die Reinheit der Probe anzuzeigen, wie das A260 / A280-Verhältnis, zum Zweck der Beurteilung der Reinheit der Probe, da der Absorptionspeak des Proteins ist 280 nm. Reine Proben haben ein Verhältnis von mehr als 1,8 (DNA) oder 2,0 (RNA). Wenn das Verhältnis weniger als 1,8 oder 2,0 beträgt, zeigt dies die Anwesenheit von Protein- oder Phenolsubstanzen an. A230 zeigt an, dass einige Verunreinigungen in der Probe vorhanden sind, wie Kohlenhydrate, Peptide, Phenole usw. Das Verhältnis der reinen Nukleinsäure A260 / A230 ist größer als 2,0. A320 erkennt die Trübung der Lösung und andere Störfaktoren. Reine Probe, A320 ist in der Regel 0.
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