Einführung in das Prinzip und die Anwendung allgemeiner Komponenten des Spektralphotometers

Das Spektralphotometer wird häufig in der biologischen, chemischen, klinischen und Umweltforschung eingesetzt.
Die Spektralphotometrie misst, wie viel Licht eine Chemikalie absorbieren kann, indem ein Lichtstrahl durch eine Probe in einem Spektrophotometer geleitet wird.
Durch Messen der detektierten Lichtintensität kann das Verfahren verwendet werden, um die Konzentration des gelösten Stoffes in der Probe zu bestimmen.
Das Konzept der Spektralphotometrie
Der zur Probe gesendete Strahl besteht aus einem Photonenstrahl.
Wenn die Photonen auf die Moleküle in der Probe treffen, können die Moleküle einige von ihnen absorbieren, die Anzahl der Photonen im Strahl verringern und die Intensität des Detektionssignals verringern.
Die Durchlässigkeit ist Teil des durch die Probe hindurchtretenden Lichts. Es ist definiert als die Lichtintensität, die mit der Intensität des einfallenden Lichts durch die Probe geht.
Die Extinktion ist der Transmission entgegengesetzt, entsprechend der vom Spektrophotometer gemessenen Menge.
Entsprechend der Extinktion kann die Konzentration der Lösungsprobe aus dem Gesetzentwurf nach Lambert bestimmt werden, der zeigt, dass ein linearer Zusammenhang zwischen der Extinktion und der Probenkonzentration besteht. Nach dem Lambertschen Biergesetz ist die Absorption das Produkt des Absorptionskoeffizienten, der ein Maß für die Lichtmenge ist, die der gelöste Stoff bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert, und für die Entfernung, durch die Licht hindurchgeht. Probe oder Verfahrweg und Konzentration des gelösten Stoffes. Im Allgemeinen besteht das Ziel der Absorptionsmessung darin, die Konzentration der Probe zu messen.
Komponenten des Spektrophotometers
Jedes Spektrophotometer besteht aus einer Lichtquelle, einem Kollimator (Linse oder einer Fokussiervorrichtung zum Senden starker und gerader Strahlen), einem Monochromator zum Trennen von Strahlen unterschiedlicher Wellenlänge und einem Längenwähler zum Auswählen der Welle oder Rille der gewünschten Wellenlänge. Die Wellenlänge des Lichts, das in dem in diesem Video vorgestellten Spektrophotometer verwendet wird, liegt im Bereich von ultraviolettem und sichtbarem Licht. Das Spektrophotometer umfasst auch einen Probenhalter, einen Fotodetektor und einen Bildschirm, auf dem die Ergebnisse des Detektors angezeigt werden.
Das neueste Spektrophotometer ist direkt an einen Computer gekoppelt, wo experimentelle Parameter gesteuert und die Ergebnisse angezeigt werden können.
Funktionsprinzip des Spektrophotometers
Bei der Durchführung der Spektrophotometrie ist es wichtig, je nach Art der verwendeten biologischen oder chemischen Lösung geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, z. B. das Tragen von Handschuhen.
Schalten Sie das Gerät ein und lassen Sie die Lampe und die Elektronik erwärmen, bevor Sie das UV-Vis-Spektrum der Probe messen.
Bereiten Sie eine Blindprobe derselben Lösung mit demselben pH-Wert und ähnlicher Ionenstärke vor, jedoch ohne die zu analysierenden Komponenten. Da die Küvette und das Lösungsmittel Licht dispergieren können, muss die Probe analysiert werden.
Der traditionelle Probenhalter für Spektrophotometer ist für die Aufnahme von Kunststoff- und Quarzschalen ausgelegt. Pipettieren Sie die ursprüngliche Lösung in eine Schüssel.
Nachdem Sie alle Fingerabdrücke abgewischt und auf die Außenseite der Schüssel gespritzt haben, setzen Sie die Küvette richtig in den Probenhalter ein und schließen Sie die Deckeltür.
Vergessen Sie niemals, die Tür zu schließen, da UV-Strahlung eines offenen Spektrophotometers Ihre Augen und Haut schädigen kann.
Programmieren Sie die gewünschte Wellenlänge oder den gewünschten Wellenlängenbereich, der an die Probe übertragen wird. Dies hängt von der besten Wellenlänge ab, die die zu analysierende Komponente absorbieren kann. Die Maschine wird dann durch Messen der Blindprobe auf Null gesetzt, wodurch die Bodenabsorption aufgrund des Probenpuffers subtrahiert wird.
Abhängig von der Art des Spektrophotometrie-Experiments, das Sie durchführen, kann es erforderlich sein, vor der Probenmessung eine Standardkurve zu erstellen, aus der die Konzentration der in der Probe analysierten Verbindung bestimmt werden kann.
Lassen Sie die Probe die richtige Temperatur erreichen und mischen Sie sie vorsichtig, um das Einbringen von Blasen zu vermeiden. Die Probe kann dann direkt in die Schüssel im Inneren der Maschine gegeben und abgelesen werden.
Nachdem die Extinktion der Probe gemessen wurde, wird das Experiment ordnungsgemäß berechnet. zum Beispiel, um die Konzentration oder das Enzymaktivitätsniveau zu bestimmen.
Anwendung des Spektrophotometers
Eine der häufigsten Anwendungen von Spektrophotometern ist die Messung der Zelldichte. Die Zelldichtemessung kann verwendet werden, um die logarithmische Wachstumskurve von Bakterien zu erstellen, aus der der optimale Zeitpunkt für die Integration von rekombinantem Protein bestimmt werden kann.
Das Spektrophotometer kann auch zur Messung der chemischen Reaktionsgeschwindigkeit verwendet werden. In dieser Ausführungsform wird die Absorption verwendet, um die enzymatische Reaktion zu überwachen, die mit der Zeit durch eine Zwischenreaktion von 452 nm verschwindet. Die Geschwindigkeit dieses enzymatischen Schritts kann berechnet werden, indem die Daten mit der entsprechenden Gleichung abgeglichen werden.
Durch die Einführung eines Mikrospektrophotometers ist kein Probenhalter mehr erforderlich. Diese Spektrophotometer verwenden eine Oberflächenspannung, um die Probe zu halten.
Das Mikrospektrophotometer ist die beste Wahl, um die Masse und Konzentration kleiner und teurer Proben wie Biomoleküle, einschließlich Proteine ​​und Nukleinsäuren, zu messen.
Die Absorption von Proteinen bei 280 nm hängt vom Gehalt an aromatischen Seitenketten in Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin sowie von der Disulfidbindung zwischen den beiden Cysteinen ab.
Die Proteinkonzentration kann durch seine Absorption bei 280 nm und seinen Absorptionskoeffizienten bestimmt werden, der auf der Zusammensetzung der Aminosäuren basiert.
DNA und RNA haben die maximale Absorption bei 260 nm, aus der ihre Konzentrationen bestimmt werden können. Die Reinheit von Nukleinsäuren kann auch anhand des Verhältnisses der Absorptionswerte zu bestimmten Wellenlängen bewertet werden.