Spektrophotometrische kolorimetrische Proteinquantifizierung

Spektrophotometrische kolorimetrische Proteinquantifizierung

Proteine sind normalerweise eine Mischung von Proteinen. Kolorimetrische Assays basieren auf Proteinbestandteilen: Aminosäuren (z. B. Tyrosin, Serin) reagieren mit einer zusätzlichen chromogenen Gruppe oder einem Farbstoff, um ein gefärbtes Material zu erzeugen. Die Konzentration des gefärbten Materials hängt direkt mit der Anzahl der Aminosäuren zusammen, auf die das Protein reagiert, wodurch die Proteinkonzentration widergespiegelt wird.

Kolorimetrische Methode

Es gibt verschiedene Methoden wie BCA, Bradford und Lowry.

Die Lowry-Methode: Basierend auf der frühesten Biuret-Reaktion und verbessert. Das Protein reagiert mit Cu2, um eine blaue Reaktion zu erzeugen. Die Lowry-Methode ist jedoch empfindlicher als Biuret. Der Nachteil besteht in der Notwendigkeit, nacheinander verschiedene Reagenzien zuzusetzen; Die Reaktion dauert lange. ist anfällig für Nicht-Protein-Substanzen; Proteine, die EDTA, Triton x-100 und Ammoniumsulfat enthalten, sind für diese Methode nicht geeignet.

Bicchinchonininsäuretest: Dies ist ein neuerer, empfindlicherer Proteintest. Das zu analysierende Protein reagiert mit Cu 2 in einer alkalischen Lösung unter Bildung von Cu, das mit BCA ein Chelat bildet, um eine violette Verbindung mit einem Absorptionspeak bei 562 nm zu bilden. Die lineare Beziehung zwischen der Konzentration dieser Verbindung und dem Protein ist stark und die nach der Reaktion gebildete Verbindung ist sehr stabil. Relativ zur Lowry-Methode ist die Operation einfach und die Empfindlichkeit ist hoch. Ähnlich wie die Lowry-Methode ist es jedoch anfällig für Interferenzen mit Proteinen und Detergenzien.

Die Bradford-Methode: Das Prinzip dieser Methode besteht darin, dass das Protein mit Coomassie Brilliant Blue reagiert, um eine farbige Verbindung zu erzeugen, die bei 595 nm absorbiert. Sein größtes Merkmal ist seine Empfindlichkeit, die 2-mal so hoch ist wie bei Lowry und BCA. Es ist einfacher und schneller. Es benötigt nur eine Art von Reaktionsreagens. Die Verbindung kann für 1 Stunde stabil sein, um das Ergebnis zu erleichtern; Bei einer Störung mit Lowry reagiert BCA mit Reduktionsmitteln (z. B. DTT, Mercaptoethanol). Es ist jedoch immer noch empfindlich gegenüber Detergenzien. Der Hauptnachteil besteht darin, dass unterschiedliche Standards zu großen Unterschieden in den Ergebnissen derselben Probe und zu keinen vergleichbaren Ergebnissen führen können.

Einige Forscher, die zum ersten Mal kolorimetrischen Messungen ausgesetzt sind, können durch die Ergebnisse der verschiedenen kolorimetrischen Tests verwirrt werden. Welche Art von Methoden glauben Sie verwirrt zu sein? Aufgrund der Tatsache, dass die Gruppen auf unterschiedliche Weise reagierten und die chromogenen Gruppen nicht gleich sind, werden mehrere Verfahren gleichzeitig verwendet, um die Probenkonzentrationen der gleichen Probe inkonsistent zu machen. Zum Beispiel haben Keller et al. untersuchten das Protein in der Muttermilch und fanden heraus, dass die von Lowry und BCA gemessenen Konzentrationen signifikant höher waren als die von Bradford. Der Unterschied war signifikant. Selbst wenn die gleiche Probe bestimmt wird, ist die Standardprobe, die durch dieselbe kolorimetrische Methode ausgewählt wurde, inkonsistent, und die Konzentration nach dem Test ist ebenfalls inkonsistent. Verwenden Sie zum Beispiel Lowry, um das Protein im Zellhomogenat unter Verwendung von BSA als Standard mit einer Konzentration von 1,34 mg / ml und eines Globulins als Standard mit einer Konzentration von 2,64 mg / ml zu testen. Daher ist es vorzuziehen, sich vor der Auswahl eines kolorimetrischen Verfahrens auf die chemische Zusammensetzung der zu testenden Probe zu beziehen und ein chemisch ähnliches Standardprotein als Standard zu finden. Darüber hinaus verursacht das kolorimetrische Verfahren zur Quantifizierung von Proteinen oft Probleme dahingehend, dass der Extinktionswert der Probe zu niedrig ist, was zu einer großen Differenz zwischen der gemessenen Probenkonzentration und der tatsächlichen Konzentration führt. Das Hauptproblem ist, dass die Farbe des wichtigen Teils des Spektrophotometers 1011, der Küvette, eine gewisse Halbwertszeit hat, so dass jede kolorimetrische Methode die Reaktionstestzeit auflistet. Alle Proben (einschließlich Standardproben) müssen innerhalb dieser Zeit getestet werden. Wenn die Zeit zu lang ist, wird der erhaltene Extinktionswert kleiner und der konvertierte Konzentrationswert nimmt ab. Darüber hinaus sind die Reaktionstemperatur, der pH-Wert der Lösung usw. allesamt wichtige Faktoren, die das Experiment beeinflussen. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, eine plastische Farbmessung zu verwenden. Vermeiden Sie die Verwendung von Küvetten aus Quarz oder Glas, da die Farbe nach der Reaktion dazu führen kann, dass Quarz oder Glas gefärbt wird, was zu einer ungenauen Extinktion der Probe führt.

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